培育高产抗逆作物新品种是保障粮食安全的重要策略。优异等位基因是作物育种的核心遗传基础。定向进化技术能在短时间内为目的基因赋予改进的或全新的生物学功能，可快速生成育种所需的优异等位基因，有望成为作物育种遗传资源瓶颈的有效途径。目前，已在微生物及动物细胞中建立了多种定向进化系统。但植物基因功能往往依赖植物特有的翻译后修饰、分子间相互作用及调控网络，在非植物体系中难以维持天然活性。因此，许多植物特异性基因和功能无法在异源系统中有效表征。然而，植物体内定向进化系统仍处于技术空白状态。
2025年10月2日，中国科学院微生物研究所邱金龙团队与中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队合作，在Science在线发表题为“Engineered geminivirus replicons enable rapid in planta directed evolution”的研究论文。研究团队通过工程化改造双生病毒复制子，首次在植物底盘中构建了快速且通用的体内定向进化系统GRAPE (Geminivirus Replicon-Assisted in Planta Directed Evolution)。
在植物中搭建定向进化系统的一个挑战是其较慢的增殖速率。为突破这一技术瓶颈，研究团队首先设计构建了滚环复制可与多种基因功能相偶联的人工双生病毒复制子。基于这些复制子开发了高通量植物体内定向进化系统GRAPE：体外诱变目的基因，并构建成复制子文库；根据目的基因的特性设计遗传通路，使其预期生物学功能与复制子的滚环复制正向或负向偶联；通过农杆菌渗入法将复制子文库导入本氏烟叶片，让文库在叶片内完成复制和筛选；深度测序计算每一个目的基因变体在文库中的占比变化。其中，促进病毒复制的变体会得到富集，而抑制病毒复制的变体则会被淘汰。
图 1 GRAPE系统示意图及其应用
利用GRAPE平台，研究团队对茄科中关键的辅助NLR蛋白NRC3进行了定向进化，借助细胞死亡将NRC3的功能与复制子的滚环复制相偶联，获得了一系列保留免疫活性的同时可以不受线虫效应蛋白SPRYSEC15抑制的NRC3变体。此外，针对水稻整合诱饵型NLR免疫受体Pikm-1，研究团队利用GRAPE进行两轮迭代定向进化，获得了可以同时识别稻瘟菌AVR-Pik效应子6种亚型并激发免疫反应的Pikm-1变体，系统拓展了Pikm-1的效应子识别谱。该策略为抗病作物育种创造了宝贵的遗传资源。众多不同基因亦可借助 GRAPE 系统实现功能进化。研究团队已证实，双生病毒复制子的滚环复制可与多个目的基因的生物学功能形成正向偶联。GRAPE 系统为植物基因及蛋白的工程化改造提供了快速、高效的技术平台，填补了当前植物生物学领域的一项重要空白。
中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、中国科学院微生物研究所邱金龙研究员为论文的共同通讯作者。遗传与发育生物学研究所博士后祝皓诚、微生物研究所已毕业博士生覃旭、遗传与发育生物学研究所博士研究生魏乐妍、博士后姜丹丹为该论文的共同第一作者。研究得到了国家自然科学基金、北京市乡村振兴农业科技项目、生物育种国家科技重大专项、国家重点研发计划、新基石科学基金等项目的资助。
原文链接：https://doi.org/10.1126/science.ady2167
